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關(guān)節(jié)退行性改變是老年人的常見疾病之一，關(guān)節(jié)置換術(shù)是其常用的治療方法，但術(shù)后應(yīng)注意預(yù)防靜脈血栓栓塞（venous thromboembolism，VTE）的發(fā)生［1-2］。目前，口服抗凝藥物已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中預(yù)防心血管疾病的普遍方式之一，故關(guān)節(jié)置換術(shù)后的老年患者常需長(zhǎng)期服用抗凝藥，其也是行口腔種植術(shù)的主要群體之一。傳統(tǒng)抗凝藥如血小板抑制劑阿司匹林（aspirin，ASP）已被廣泛應(yīng)用于臨床各領(lǐng)域，除被推薦為預(yù)防冠心病的二級(jí)用藥外［3］，也被證實(shí)可用于老年患者骨科手術(shù)后VTE的預(yù)防［4-5］，推薦劑量一般為75 ~ 300 mg/次；1次/d［6-7］。而新型抗凝藥利伐沙班（rivaroxaban，RIV）是首個(gè)口服凝血因子Ⅹa抑制劑，治療窗范圍較廣［8-10］，可單獨(dú)用于預(yù)防骨科術(shù)后VTE。10 ~30 mg/次、1 次/d 劑量的抗血栓效果優(yōu)于依諾肝素［9］，且無(wú)需常規(guī)的凝血功能監(jiān)測(cè)，是代替維生素K抑制劑及低分子量肝素預(yù)防和治療血栓等并發(fā)癥有效且安全的藥物［11］。

研究表明，種植早期失敗率比晚期更高［12］，約30%的早期種植失敗發(fā)生于植入后1個(gè)月內(nèi)［13］，觀察種植體周圍早期骨結(jié)合過(guò)程及衡量早期種植體-骨結(jié)合率（bone-implant contact，BIC）是預(yù)判種植術(shù)是否成功的重要方法。種植體植入后會(huì)引起周圍組織的損傷并形成血凝塊，血凝塊不僅可為新生骨細(xì)胞從原骨壁遷移到種植體表面提供橋梁，還為早期骨結(jié)合提供了營(yíng)養(yǎng)［14］。而抗凝藥能通過(guò)多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑影響成骨及破骨細(xì)胞的分化和增殖，進(jìn)而影響骨生成及骨改建［15］，故口腔種植術(shù)前患者口服抗凝藥常會(huì)影響治療效果。但是，若停用抗凝藥則會(huì)增加關(guān)節(jié)置換術(shù)后的老年患者VTE的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要尋找一種可在口腔種植術(shù)前口服的抗凝藥。目前，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)比較傳統(tǒng)抗凝藥和新型抗凝藥對(duì)種植體-骨結(jié)合影響的研究較少，故本研究通過(guò)建立大耳白兔動(dòng)物模型，模擬并比較ASP和RIV對(duì)早期BIC的影響，以期為臨床上新型抗凝藥物RIV能否在口腔種植術(shù)前使用提供參考依據(jù)。

本研究于2019年9月至2020年2月在青島市口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，經(jīng)青島市口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審批通過(guò)（批準(zhǔn)號(hào)：2019KQYX011）。

99.99%純鈦種植體（威海市威高集團(tuán)有限公司），種植體設(shè)計(jì)圖見圖1；RIV（上海源葉生物科技有限公司）；ASP（阿斯利康，英國(guó)）；丙泊酚（西安力邦制藥有限公司）；咪達(dá)唑侖（杭州瑞太醫(yī)藥科技有限公司）；鹽酸阿替卡因（碧蘭，法國(guó)）；恩諾沙星注射液（拜爾，德國(guó)）；Micro-CT（μCT-100，SCANCO Medical AG，瑞士）；硬組織切磨系統(tǒng)（EXAKT，德國(guó)）。

1. 2. 1 動(dòng)物模型建立與分組

選取12只4月齡新西蘭大耳白兔，平均體質(zhì)量3.5 kg。按后續(xù)灌胃方式的不同，將白兔隨機(jī)分為3組，分別為空白對(duì)照組、ASP組和RIV組；每組各4只，每只白兔植入4顆種植體，共48顆。將白兔置于青島市口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌動(dòng)物房中適用性飼養(yǎng)7 d后開始灌胃。按人類推薦最大用藥劑量換算白兔用藥劑量，其中人類及白兔體表面積比例系數(shù)分別為70 kg和1.5 kg，換算系數(shù)為0.07，人類體質(zhì)量按60 kg計(jì)算［16］。計(jì)算公式：白兔每次用藥劑量=人類推薦最大用藥劑量/ 60 × 70 × 0.07 / 1.5 。灌胃方式：空白對(duì)照組使用普通生理鹽水灌胃，10 mL/次，1次/d；ASP組按人類推薦最大用藥劑量300 mg/次、1次/d換算［6-7］，則白兔每次用藥劑量為16.4 mg/kg，即每次使用含有57.4 mg ASP 的生理鹽水灌胃，10 mL/次，1 次/d；RIV 組按人類推薦最大用藥劑量30 mg/d的劑量換算［8-10］，白兔每次用藥劑量為1.6 mg/kg，即每次使用含有5.6 mg RIV的生理鹽水灌胃，10 mL/次，1次/d。3組白兔連續(xù)灌胃7 d后，動(dòng)物模型即建立完成。

1. 2. 2 凝血功能的比較待白兔動(dòng)物模型建立

完成后，取白兔耳緣靜脈血，以國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（in?ternational normalized ratio，INR）來(lái)衡量凝血功能，若3組白兔INR無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，則可行后續(xù)手術(shù)。

1. 2. 3 種植手術(shù)

3組白兔術(shù)前12 h禁飲食。使用咪達(dá)唑侖、丙泊酚行耳緣靜脈注射麻醉。白兔仰臥于無(wú)菌手術(shù)臺(tái)上，備皮、消毒、鋪巾。再使用1.7 mL的4%鹽酸阿替卡因局部麻醉，以防止術(shù)中白兔出現(xiàn)后肢抽搐。選擇白兔雙腿膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)近干骺端作為切口縱向切開約20 mm，翻瓣，暴露脛骨干骺端，每條腿兩植入點(diǎn)間隔約3 mm，球鉆定位，轉(zhuǎn)速為1200 r/min，先鋒鉆預(yù)備深約5 mm，擴(kuò)孔鉆逐級(jí)預(yù)備直徑3.3 mm、深約8 mm的窩洞，術(shù)中不斷以生理鹽水冷卻降溫，最終以5 ~ 10 N·cm的扭力在發(fā)育線兩側(cè)各植入1顆99.99%純鈦種植體，種植體頂端位于骨面下1 mm。可吸收縫合線分層縫合創(chuàng)口，消毒術(shù)區(qū)，術(shù)后注射恩諾沙星注射液預(yù)防感染。術(shù)區(qū)拍攝錐形束CT（cone beam CT，CBCT），確認(rèn)種植體的三維位置（圖2）。術(shù)后8 h實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按原分組的灌胃方式繼續(xù)飼養(yǎng)。為保證第2、4周每組白兔及種植體數(shù)量一致，且每組種植體數(shù)量不少于3顆，按如下方法行后續(xù)實(shí)驗(yàn)：在第2、4周分別選取每組2只白兔的8顆種植體行后續(xù)研究，其中3顆種植體及周圍組織行Micro-CT掃描及三維模型重建，其余5顆種植體及周圍組織制作種植體-骨組織標(biāo)本并進(jìn)行組織學(xué)染色。

1. 2. 4 Micro-CT 及三維模型重建

術(shù)后第2、4周均使用Micro-CT掃描每組白兔術(shù)區(qū)的3顆種植體及其周圍組織，并以種植體長(zhǎng)軸為中軸線取直徑2.8 mm的圓柱形進(jìn)行掃描和三維模型重建。將種植體頂端向下2 mm設(shè)為上界，種植體根部向上2 mm設(shè)為下界，兩界之間約3 mm設(shè)定為感興趣區(qū)域。使用Evalustion 6.53圖像分析軟件（SCANCO Medical AG，瑞士）對(duì)BIC進(jìn)行定量分析。通過(guò)肉眼觀察Micro-CT圖像中灰色骨小梁密度和三維重建圖像中紅色骨組織體積，來(lái)比較骨密度；再通過(guò)三維模型重建圖像計(jì)算并比較每組感興趣區(qū)域BIC的差異。計(jì)算公式：BIC=螺紋內(nèi)新生骨面積/螺紋內(nèi)腔總面積× 100%。

1. 2. 5 種植體-骨組織標(biāo)本及組織學(xué)染色

術(shù)后第2、4周，分別各沿5顆種植體長(zhǎng)軸切取種植體-骨組織標(biāo)本。制成長(zhǎng)10 mm、寬10 mm、厚15 mm的不脫鈣種植體-骨組織磨片。行亞甲基藍(lán)-酸性品紅染色，通過(guò)觀察磨片中骨小梁稀疏程度確定骨密度。計(jì)算感興趣區(qū)域的BIC。計(jì)算公式：BIC=螺紋內(nèi)骨結(jié)合長(zhǎng)度/螺紋內(nèi)腔總長(zhǎng)度× 100%。

應(yīng)用SPSS 20.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用單因素方差分析比較各組INR差異；采用雙因素方差分析及多重比較分析不同組別及各時(shí)間點(diǎn)BIC的差異。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

動(dòng)物模型建立后，檢測(cè)3組白兔的INR。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組、ASP組和RIV組的INR分別為0.90 ± 0.13、0.92 ± 0.12、0.90 ±0.13，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 0.034，P = 0.967），可行后續(xù)研究。

術(shù)后第2周，Micro-CT及三維模型重建圖像可見3組種植體螺紋內(nèi)均有新生骨長(zhǎng)入；空白對(duì)照組、RIV組分別與ASP組相比，新生骨小梁密度均較高。術(shù)后第4周情況與第2周類似，但3組骨小梁密度及骨量均較第2周時(shí)明顯增高。見圖3 ~ 4。

3組三維模型重建圖像BIC的比較結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，3組BIC逐漸升高（F = 55.812，P < 0.001）；不同測(cè)量時(shí)間點(diǎn)3組BIC的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 19.007，P < 0.001）；且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)差異無(wú)明顯變化（F = 0.031，P = 0.970）。其中術(shù)后第2、4周，空白對(duì)照組及RIV組的BIC均大于ASP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；而空白對(duì)照組與RIV組BIC的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；且每組第4周的BIC均大于第2周，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表1。

可清晰觀察到新生骨與基骨之間的界限，細(xì)長(zhǎng)的新生骨小梁相互交織，且大部分位于種植體螺紋腔內(nèi)。間質(zhì)內(nèi)有較多成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管及類骨質(zhì)。空白對(duì)照組和RIV組相對(duì)于ASP組新生骨小梁較多，主要集中于種植體螺紋側(cè)壁上。術(shù)后第4周相較于第2周種植體周圍新生骨量及骨小梁密度明顯增加。見圖5。

3組染色圖像BIC的比較結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，3 組BIC 逐漸升高（F = 109.380，P <0.001）；不同測(cè)量時(shí)間點(diǎn)3組BIC的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 67.609，P < 0.001）；且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)差異無(wú)明顯變化（F = 2.459，P = 0.107）。其中術(shù)后第2、4周，空白對(duì)照組及RIV組的BIC均大于ASP組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）；而空白對(duì)照組與RIV組BIC的比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。且3組第4周BIC均大于第2周，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表2。

臨床上ASP 和RIV 均可用于關(guān)節(jié)置換術(shù)后VTE的預(yù)防。ASP在臨床上被推薦為預(yù)防冠心病的二級(jí)用藥［3］，也可作為骨科手術(shù)后血栓栓塞的預(yù)防［4-5］；RIV除了可聯(lián)合抗血小板藥物預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化血栓的形成外［17］，也同時(shí)具有預(yù)防及治療骨科大手術(shù)后VTE的作用［10］。有研究證明，兩者對(duì)于預(yù)防關(guān)節(jié)置換術(shù)后VTE 形成無(wú)明顯作用差異［18-19］。在口腔種植術(shù)中，術(shù)區(qū)翻瓣和備洞的過(guò)程會(huì)引起牙齦組織、骨膜、骨髓腔內(nèi)的毛細(xì)血管斷裂，在種植體周圍形成血凝塊，血凝塊在早期骨結(jié)合過(guò)程中起關(guān)鍵作用［14，20］。而抗凝藥可使機(jī)體處于低凝血狀態(tài)，降低血凝塊的形成速率，可能會(huì)影響種植體-骨結(jié)合過(guò)程。

ASP是一種非甾體抗炎藥，同時(shí)也具有預(yù)防血栓形成的作用。有研究表明，ASP對(duì)骨形成過(guò)程中成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的影響與使用劑量相關(guān)［21］。目前研究認(rèn)為，ASP可通過(guò)影響前列腺素E2的合成影響骨代謝的過(guò)程。前列腺素E2一方面可抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡促進(jìn)成骨分化，通過(guò)環(huán)氧輔酶2-前列腺素E2-前列腺素E受體4信號(hào)通路參與膜內(nèi)成骨和軟骨化骨并影響新生骨的質(zhì)量與強(qiáng)度［22］；另一方面還可促進(jìn)成骨細(xì)胞中核因子κB受體活化因子配體的表達(dá)，在骨穩(wěn)態(tài)中下調(diào)并抑制骨保護(hù)素的作用［23-24］。本研究中，ASP組白兔Micro-CT 和組織學(xué)染色證明其骨髓腔較大，骨小梁較空白對(duì)照組及RIV 組稀疏，且早期BIC較其余兩組低，說(shuō)明ASP組白兔骨密度低，可能會(huì)造成種植體-骨結(jié)合失敗率增加，與Winnett等［25］研究非甾體抗炎藥對(duì)種植體-骨結(jié)合影響的結(jié)果相似。

目前，對(duì)于長(zhǎng)期口服新型抗凝藥是否會(huì)延長(zhǎng)骨折愈合周期存在爭(zhēng)議。Pilge等［26］通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在骨愈合的初期，RIV 對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移、增殖、成骨標(biāo)志物mRNA的表達(dá)影響很小，且不影響成骨分化。也有證據(jù)表明，RIV抑制骨折愈合第一階段的骨形成［27］。Xia等［28］推測(cè)RIV主要影響松質(zhì)骨的骨量，而對(duì)骨密度和骨質(zhì)結(jié)構(gòu)無(wú)明顯影響。本研究中，組織學(xué)染色觀察到空白對(duì)照組與RIV組中骨密度類似，豐富的新生骨小梁爬行在種植體螺紋表面和手術(shù)窩洞空隙處，較ASP組明顯增多；計(jì)算BIC后發(fā)現(xiàn)，術(shù)后第2、4周空白對(duì)照組和RIV組BIC的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而空白對(duì)照組和RIV組的BIC均比ASP組高，Mi?cro-CT 及三維模型重建圖像結(jié)果與上述結(jié)果相同，說(shuō)明ASP相較于RIV會(huì)對(duì)早期BIC產(chǎn)生抑制作用，而RIV對(duì)早期BIC抑制作用不明顯，新型口服抗凝藥物RIV可能無(wú)抑制種植體早期骨結(jié)合的副反應(yīng)。但研究結(jié)果還存在一定的局限性。在研究中對(duì)白兔脛骨進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)，白兔脛骨干骺端髓腔粗大，松質(zhì)骨較少，說(shuō)明RIV對(duì)白兔的影響可能相對(duì)人類較小；且本研究選擇的種植體表面進(jìn)行了酸蝕噴砂的粗糙化處理，這種處理增加了種植體和骨組織的接觸面積，可以獲得良好的生物活性表面［29］，但降低了種植體表面成骨對(duì)RIV的敏感性。

綜上，ASP對(duì)種植體早期骨結(jié)合具有抑制作用，而RIV作為一種具有代表性的新型口服抗凝藥物對(duì)種植體早期骨結(jié)合并無(wú)明顯的抑制作用。因此，關(guān)節(jié)置換術(shù)后的老年患者若擬行口腔種植術(shù)，可在無(wú)需停藥的情況下優(yōu)先選擇新型口服抗凝藥RIV，最大限度保證種植成功率。